本发明主要提供了一种明胶中伯胺基含量的测定方法，通过该方法可以较为准确的测量明胶中伯胺基的含量，属于化学检测技术领域。
背景技术：
明胶中伯胺基的定量对于明胶化学改性有重要意义，目前测量伯胺基的方法有很多：Doi等(Doi E，Shibata D，Matoba T.Modified colorimetric ninhydrin methods for peptidase assay[J].Anal Biochem，1981，118(1):173-184)用茚三酮与伯氨反应生成生色团,578nm下检测吸光值定量得到氨基含量，此方法操作相对繁琐，需要在沸水浴中反应，并且只对氨基酸的检测较灵敏，对于含有多种氨基酸的明胶，测定伯胺含量的影响因素较多，准确性大大降低。用芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)与伯胺反应，得到的衍生物具有荧光特性，可定量检测伯胺含量，但Fmoc-Cl与伯胺、仲胺均可反应，Fmoc-Cl、反应所得衍生物及水解产物均具有类似的荧光，因此采用该方法需排除干扰物的的影响，增加了检测的局限性。邻苯二甲醛(OPA)在巯基乙醇的存在下可与伯胺快速反应，所得衍生物可进行紫外或荧光的定量检测，缺点是巯基乙醇的味道很难闻，所得衍生物不够稳定(瞿其曙，汤晓庆，胡效亚，李寿椿.柱前衍生法在氨基酸分析测定中的应用[J].化学进展,2006,18(6):789-793)。Shengxiang Ji等(Shengxiang Ji,Thomas R.Hoye,Christopher W.Macosko.Primary Amine(-NH2)Quantification in Polymers:Functionality by 19F NMR Spectroscopy[J].Macromolecules,2005,38(11):4679-4686)通过伯胺与三氟甲基芳香醛反应生成含氟的席夫碱，再通过氟核磁19F NMR定量检测，由此得到聚合物表面的伯胺量，该方法用到氟试剂及核磁仪，测试的成本较高。Weigele等(M.Weigele,S.L.DeBernardo,J.P.Tengi,W.Leimgruber.Novel reagent for the fluorometric assay of primary amines[J].J.Am.Chem.Soc.1972,94(16):5927-5928)于1972年首次合成荧光胺并发现了荧光胺与伯胺可在常温下迅速高效反应生成具有强荧光特性的衍生物。蛋白质中伯胺与荧光胺反应生成发荧光的化合物，其荧光强度与蛋白质的含量成正比，因此可用于测定蛋白质的含量。
对于明胶中伯胺基含量的测定，需要排除明胶本身荧光性的影响，同时提高测量的准确性。因此，对于测量工艺进行全新的探索研究，特提出本发明。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，尤其是测量结果不准确的问题，本发明提供一种测量明胶中伯胺基含量的方法。
本发明的技术方案如下：
一种测量明胶中伯胺基含量的方法，包括：
将已知结构的含有伯胺基的氨基酸作为标准氨基酸，与荧光胺反应，测定伯胺浓度与荧光强度对应的标准曲线；
将不同浓度的明胶溶液与荧光胺溶液反应，测试荧光强度；
利用标准曲线，根据荧光强度确定不同浓度明胶溶液中的伯胺浓度；
绘制明胶浓度和伯胺浓度的对应关系曲线，曲线的斜率即为每克明胶中伯胺的含量。
根据本发明，优选的，所述的标准氨基酸选为甘氨酸、亮氨酸、精氨酸或赖氨酸，标准氨基酸与荧光胺的反应摩尔比为1:1-1:4；最优选1:4。
根据本发明，优选的，将标准氨基酸以缓冲溶液配置成标准氨基酸溶液，与荧光胺溶液进行反应。
根据本发明，优选的，缓冲溶液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，缓冲溶液的pH是影响反应和测试准确性的关键，pH值在8-11时能够测得较强的荧光信号，pH为10时的荧光强度最大。缓冲溶液的pH值超出8-11，会使荧光信号的发射波长出现偏差，使得检测无法进行。
根据本发明，优选的，以缓冲溶液配置成标准氨基酸溶液的浓度为(0.5-1.5)×10-6mol/mL根据本发明，优选的，所述的荧光胺溶液为荧光胺的丙酮溶液，进一步优选的，浓度为0.4-0.6mg/mL。
根据本发明，优选的，标准氨基酸溶液与荧光胺溶液在避光条件下进行反应；优选的，反应时间为5-10分钟；
优选的，反应完成后，将反应液稀释成一系列不同浓度的溶液，浓度范围为(0.5-3)×10-7mmol/mL，测定此浓度范围内的荧光强度，绘制出伯胺浓度与荧光强度的标准曲线。
根据本发明，优选的，用pH值为8-11的缓冲溶液配制明胶溶液，与荧光胺丙酮溶液在避光条件下进行反应；明胶溶液的浓度范围对其中的伯胺能否与荧光胺反应完全有较大影响，反应不完全将使得测试结果不准确。明胶溶液浓度过低会导致与荧光胺反应不完全，使得测试结果不准确，浓度过高会导致明胶分子之间互相缠绕，使得测试结果偏低。优选的，明胶溶液的质量浓度范围为(1.5-5)×10-4g/mL。反应时间为5-10分钟。反应过程用过量的荧光胺进行反应，反应剩余的荧光胺会水解，对测试结果不产生影响。反应完成后，以缓冲溶液将反应液稀释成(3-12)×10-7g/mL的溶液，测定荧光强度，利用标准曲线得到不同质量浓度明胶中伯胺的浓度。绘制得到明胶缓冲溶液的质量浓度与伯胺浓度的关系曲线，曲线的斜率即每克明胶中伯胺的物质的量。
本发明的原理：
本发明是在Weigele实验原理的基础上，利用荧光胺与明胶中所含氨基酸的伯胺反应生成特定的具有强荧光特性的衍生物，该衍生物在波长为380nm的激发光的激发下，产生的最大强度的荧光发射波长为503nm。
反应过程如下：
利用这一原理，将已知结构的含有伯胺基的氨基酸作为标准氨基酸，与荧光胺反应，测定伯胺浓度与衍生物荧光强度的关系，以此为标准曲线确定明胶中伯胺的含量。
为了排除明胶本身对测试的影响，对单纯的明胶溶液进行了荧光强度的测试，如图1所示。由图1可知，单纯明胶溶液在380nm激发光的激发下，在443nm附近有荧光峰，而在503nm附近没有荧光峰，证明了503nm附近的荧光峰完全是由伯胺与荧光胺反应生成的衍生物所产生，与明胶本身自带的荧光没有关系。
本发明的有益效果：
1、本发明方法操作简单、无需外加复杂条件、测量灵敏迅速、精度高。
2、本发明排除了明胶本身的荧光性对实验操作的影响，测量结果准确。
3、本发明所需用的氨基酸是常用的标准氨基酸甘氨酸、精氨酸、亮氨酸、赖氨酸等试剂，易于获得。
4、本发明采用多点测试确定明胶中伯胺的浓度，减少了测试的误差，结果准确，准确性高达99％以上。
附图说明
图1为本发明中明胶溶液与荧光胺反应后的荧光发射光谱，以及单纯明胶的荧光发射光谱。
图2为本发明实施例1甘氨酸溶液中伯胺浓度与相对荧光强度的标准曲线。
图3为本发明实施例1中通过甘氨酸标准曲线得出的明胶伯胺浓度与明胶质量浓度的关系曲线。
图4为本发明实施例2亮氨酸溶液中伯胺浓度与相对荧光强度标准曲线。
图5为本发明实施例2中通过亮氨酸标准曲线得出的明胶伯胺浓度与明胶质量浓度的关系曲线。
图6为本发明实施例3精氨酸溶液中伯胺浓度与相对荧光强度标准曲线。
图7为本发明实施例3中通过精氨酸标准曲线得出的明胶伯胺浓度与明胶质量浓度的关系曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例并结合附图对本发明做进一步说明，但不限于此。
实施例中所用原料如无特殊说明，均为常规市购产品。其中，所用的缓冲溶液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液。
实施例1
一种测量明胶中伯胺基含量的方法，包括步骤如下：
(1)取0.022g甘氨酸溶于25mL的pH为10的缓冲溶液，以相同缓冲溶液稀释十倍，称取荧光胺2.2mg溶于5mL丙酮中配制荧光胺丙酮溶液，移取三等份每份250μL稀释后的甘氨酸缓冲溶液，分别加375μL，560μL，750μL的荧光胺丙酮溶液，在无光的条件下反应10分钟，反应完成之后每份加缓冲溶液稀释至25mL。
用荧光光谱仪(HITACHI F-4600)测量每个溶液的荧光强度，测量时激发波长设置为380nm，电压设置为600v,发射波长为503nm时的最大相对荧光强度分别为1146,1339,1367。选取荧光强度最大的甘氨酸荧光胺溶液，从中依次取0.08mL，0.1mL，0.12mL，0.14mL，0.16mL，0.18mL，0.2mL以pH为10的缓冲溶液稀释至10mL，测定其在503nm的相对荧光强度。
根据甘氨酸溶液中伯胺浓度与测试得到的荧光强度，做出标准曲线，如图2所示。曲线方程为y＝14.09x+1.35，相关度：R2＝0.992。
(2)称取0.05g明胶溶于25mL的pH为10的缓冲溶液，移取2.5mL以pH为10的缓冲溶液稀释至25mL，移取稀释后的溶液250μL加入375μL的荧光胺丙酮溶液，在无光条件下反应10min，以pH为10的缓冲溶液稀释至25mL，分别移取该溶液0.08mL，0.1mL，0.12mL，0.14mL，0.16mL，0.18mL，0.2mL，以pH为10的缓冲溶液稀释至10mL，用荧光光谱仪(HITACHI F-4600)测量每个溶液的荧光强度，测量时激发波长设置为380nm，电压设置为600v。
(3)利用图2中甘氨酸的标准曲线，根据测量的每个明胶溶液的相对荧光强度，得到明胶的伯胺浓度，绘制明胶质量浓度与伯胺浓度的关系曲线如图3，关系曲线为：y＝0.3x+0.03，相关度：R2＝0.994。根据曲线的数学意义，斜率就是每克明胶中伯胺的物质的量，即0.3mmol/g明胶。
实施例2
一种测量明胶中伯胺基含量的方法，包括步骤如下：
(1)称取0.039g亮氨酸溶于25mLpH为10缓冲溶液，以相同缓冲溶液稀释十倍，称取荧光胺2.2mg溶于5mL丙酮中配制荧光胺丙酮溶液，移取三等份每份250μL稀释后的亮氨酸缓冲溶液，分别加375μL，560μL，750μL的荧光胺丙酮溶液，在无光的条件下反应10分钟，反应完成之后每份加缓冲溶液稀释至25mL。
用荧光光谱仪(HITACHI F-4600)测量每份的荧光强度，测量时激发波长设置为380nm，电压设置为600v,发射波长为503nm时的最大相对荧光强度分别为：934,989,1099。
选取荧光强度最大的亮氨酸荧光胺溶液，从中依次取0.08mL，0.1mL，0.12mL，0.14mL，0.16mL，0.18mL，0.2mL以pH为10的缓冲溶液稀释至10mL，测定其在503nm的相对荧光强度。
根据亮氨酸中伯胺浓度与测试得到的荧光强度，做出标准曲线如图4，曲线方程为y＝11.92x+3，相关性R2＝0.996。
(2)称取0.05g明胶溶于25mL pH为10的缓冲溶液，移取4mL以pH为10的缓冲溶液稀释至25mL，移取稀释后的溶液250μL加入375μL的荧光胺丙酮溶液，在无光条件下反应10min，以pH为10的缓冲溶液稀释至25mL，分别移取该溶液0.08mL，0.1mL，0.12mL，0.14mL，0.16mL，0.18mL，0.2mL，以pH为10的缓冲溶液稀释至10mL，用荧光光谱仪(HITACHI F-4600)测量每份的荧光强度，测量时激发波长设置为380nm，电压设置为600v。
(3)利用亮氨酸的标准曲线，根据测量的每个明胶溶液的相对荧光强度，得到明胶溶液中的伯胺浓度，绘制明胶质量浓度与伯胺浓度的关系曲线如图5所示。关系曲线为：y＝0.31x-0.09，R2＝0.991。根据曲线的数学意义，斜率就是每克明胶中伯胺的物质的量，即0.31mmol/g明胶。
实施例3
一种测量明胶中伯胺基含量的方法，包括步骤如下：
(1)称取0.0258gL-精氨酸溶于pH为10的缓冲溶液，以相同缓冲溶液稀释十倍，称取荧光胺2.2mg溶于5mL丙酮中配制荧光胺丙酮溶液，移取三等份每份250μL稀释后的精氨酸缓冲溶液，分别加375μL，560μL，750μL的荧光胺丙酮溶液，在无光的条件下反应10分钟，反应完成之后每份加缓冲溶液稀释至25mL。
用荧光光谱仪(HITACHI F-4600)测量每份的荧光强度，测量时激发波长设置为380nm，电压设置为600v,发射波长为503nm时的最大相对荧光强度分别为：855,887,910。选取荧光强度最大的精氨酸荧光胺溶液，从中依次取0.08mL，0.1mL，0.12mL，0.14mL，0.16mL，0.18mL，0.2mL以pH为10的缓冲溶液稀释至10mL，测定其在503nm的相对荧光强度。
根据精氨酸中伯胺浓度与测试得到的荧光强度，做出标准曲线如图6，曲线方程为：y＝10.57x+0.86，相关性R2＝0.992。
(2)称取0.05g明胶溶于25mL pH为10的缓冲溶液，移取5mL以pH为10的缓冲溶液稀释至25mL，移取稀释后的溶液250μL加入375μL的荧光胺丙酮溶液，在无光条件下反应10min，以pH为10的缓冲溶液稀释至25mL，分别移取该溶液0.08mL，0.1mL，0.12mL，0.14mL，0.16mL，0.18mL，0.2mL，以pH为10的缓冲溶液稀释至10mL，用荧光光谱仪(HITACHI F-4600)测量每份的荧光强度，测量时激发波长设置为380nm，电压设置为600v。
(3)根据测量的明胶溶液的相对荧光强度，由精氨酸的标准曲线，得到明胶溶液中的伯胺浓度，绘制明胶质量浓度与伯胺浓度的关系曲线如图7，关系曲线为：y＝0.36x-0.28，相关性R2＝0.989，根据曲线的数学意义，曲线的斜率就是每克明胶中伯胺的物质的量即0.36mmol/g明胶。
对比例1
如实施例1所述，不同的是：
使用pH值为的4.5的醋酸钠缓冲溶液配制氨基酸溶液和明胶溶液。
在503nm附近检测不到荧光峰。
对比例2
如实施例1所述，不同的是：
使用pH为12的氯化钾氢氧化钠缓冲溶液配制氨基酸和明胶溶液。
最后得出的每克明胶中伯胺基的含量为0.17mmol/g。
对比例3
如实施例1所述，不同的是：
称取0.05g明胶溶于25mL pH为10的缓冲溶液，移取0.5mL以pH为10的缓冲溶液稀释至25mL，取0.25ml与荧光胺溶液反应，测量伯胺浓度。
测量其发射光谱的时候发现发射波长出现偏移现象，测量结果如同对比例1。
对比例4
如实施例1所述，不同的是：
称取0.5g明胶溶于25mL pH为10的缓冲溶液，取0.25ml与荧光胺溶液反应，测量伯胺浓度。
计算得出每克明胶中伯胺的含量为0.08mmol/g。
试验例1
用上述实施例1中甘氨酸的标准曲线，计算每克甘氨酸中伯胺的浓度。
计算得出每克甘氨酸中伯胺的含量为0.0134mol/g，而实际每克甘氨酸中伯胺的含量为0.0133mol/g。
可知，测量伯胺基含量的测定准确性为99.25％。